​

蛋白質被應用於各個領域，如食品、製藥、生物化學、生物學，而在醫學研究中，高濃度蛋白質分散配方面臨巨大挑戰，尤其是為了降低注射頻率而進行的長期投遞策略，在這個條件下，為了使每次投藥的量充足，因此單次施打的濃度便會提高，而在這個條件下蛋白質要保持良好分散、避免凝聚並保持其空間結構穩定的能力，這會受到各種因素的影響，如溫度、鹽濃度或氨基酸添加。 

蛋白質穩定性(凝聚)通常會通過黏度測量進行研究，因為蛋白質變性會導致黏度增加，另一方面，動態光散射（DLS）或Zeta電位也是常見的方法，但這個方法需要對樣品進行大量稀釋。 

在本篇文章中，我們通過使用靜態多重光散射技術（SMLS）測量高濃度蛋白樣品的平均顆粒直徑來反推蛋白質的凝聚狀況，這種技術的好處是無需對樣品進行稀釋，可以用最原始的狀態執行實驗，這很重要，因為稀釋也可能影響顆粒的大小，並且對數據產生誤判。 
 

材料與方法: 

▪️ 牛血清白蛋白蛋白質（BSA）以10%重量濃度分散在水中，並添加不同量的氨基酸histidine（從3到20nM），在60°C下進行分析。 
▪️ BSA以不同濃度（4%至10%重量）在25°C下進行分析。 
 
Turbiscan®技術使用一種非侵入性的光學方法（光源波長880nm），能夠直接測量平均粒徑(d)，根據米氏理論，利用光信號強度以及連續相（nf）和分散相（np）的折射率以及顆粒濃度（φ）帶入下列公式進行粒徑計算： 
其中BS為背向光散射訊號強度，T為穿透光訊號強度 
 

實驗結果: 

案例1 - 溫度和組氨酸對蛋白質聚集隨時間變化的影響 
溫度升高導致蛋白質變性，這包括修改相互作用，並導致由於粒徑增加而變得不透明的樣品。組氨酸，一種氨基酸，通常被用來保護治療性蛋白質免受變性的影響。BSA蛋白質在10%重量濃度下進行分析，在室溫下樣品相當透明，但在60°C時，對於組氨酸含量較低的樣品，從透明轉變為不透明，如圖1所示。該圖顯示了直接從傳遞信號獲得的原始數據。 
圖一、在60°C下，分析含有不同組氨酸含量（mM）的BSA樣品的穿透光強度（％）隨時間的變化 
 

以下的圖表顯示了在不進行稀釋的情況下，BSA分散體在不同組氨酸濃度下隨著老化時間的直徑變化。 
圖二、分析含有不同組氨酸含量（mM）的BSA樣品的顆粒平均粒徑隨時間的變化 
圖三、在分析20小時後，將樣品組氨酸含量（mM）和顆粒粒徑作圖 

從上兩張圖可以發現，隨著添加的組氨酸的量提升，樣品的粒徑越能維持在接近原始狀態(較小)，意味著變性程度的減緩。 


案例2 – 樣品製備後測量蛋白質大小和濃度的關係 
我們還測量了在25°C下，樣品剛準備好的的蛋白粒徑(不同BSA濃度)，並且比較了以SMLS技術和DLS技術的粒徑測量結果，參見下表格及圖四: 
 
BSA DLS SMLS
concentration state Diameter state diameter
1% ND 8 nm ND NA
4% D 8 nm ND 25 nm
10% D 8 nm ND 60 nm
(ND = Non Diluted and D = Diluted)
圖四、蛋白質平均粒徑與BSA濃度的作圖 

使用SMLS得到的結果顯示，增加BSA濃度會增加粒徑，這是由於蛋白質-蛋白質相互作用導致，如靜電吸引，但與SMLS相對的是需要對樣品進行大量稀釋以改善測量品質的DLS技術無法檢測到這種濃度效應，測量時的稀釋可能會破壞蛋白質的聚集體並重新分散，因此在檢驗蛋白濃度對粒徑影響的實驗目的上，我們會更加推薦使用SMLS方法。 
 

結論: 

基於SMLS技術的Turbiscan在本篇文章中被用於測量蛋白質樣品的粒徑，用以反推蛋白質變性程度，在0.0001％至95％之間的大範圍濃度內，粒徑在10nm到1000μm之間的樣品，此項技術均適用，而這種技術的優勢在於能夠在不稀釋樣品的情況下完成測量，除了粒徑，Turbiscan LAB還可以比較不同樣品的物理穩定性。 
 

擁有SMLS技術的Turbiscan

​
TURBISCAN 為全球第一項獲得專利的技術工具，可對未受應力的產品進行加速老化測試，透過靜態多重光散射（SMLS）的應用，允許對原生濃縮液體分散物進行直接測量；產品提供包括 Turbiscan 穩定性指數（TSI）等多樣參數，方便為不同配方的物理穩定性參數進行比較以及觀測——只需點擊一次，便可便利輸出可比較和可複製的參數結果，成為實驗室中不可或缺的角色。

​
 
觀看其他儀器